林烟草KUP/HAK/KT钾转运体基因NsHAK11的亚细胞定位与表达
摘要
【目的】应用生物信息学方法，分离和克隆烟草钾转运体KUP／HAK／KT家族新基因，对其进行亚细胞定位和表达分析，为开展烟草KUP／HAK／KT钾转运体的研究提供借鉴。【方法】通过生物信息学方法，搜索林烟草（Nicotianasylvestris）和绒毛状烟草（Ntomentosiformis）基因组数据库，预测两种烟草中的钾转运体KUP／HAK／KT家族成员，构建系统进化树。根据所获结果，从林烟草中获得一个新的烟草KUP／HAK／KT家族基因。采用W01fPSORT对蛋白的亚细胞定位进行预测，并利用农杆菌浸润法注射本生烟（彤benthamlana）叶片后激光共聚焦显微镜下观察，依据融合荧光蛋白在细胞内产生荧光的位置确定蛋白的亚细胞定位，用以验证预测结果；采用PLACE网站对基因的表达模式进行预测，并用荧光定量PCR分别研究其在盛花期林烟草不同器官的表达差异及低温、高温和低钾胁迫下苗期林烟草叶片中5sHAK／1的表达变化，用以验证预测结果。I结果】预测出林烟草和绒毛状烟草KUP／HAK／KT钾转运体家族均含有19个成员，进化上分为4个Cluster（簇）。根据预测序列结果，从林烟草中克隆得到一个Clusterlll中的基因，其编码蛋白与拟南芥（Arabidopsisthaliana）中AtKUPll的相似性最高，因此，将其命名为NsHAKll，其编码蛋白与已获得的2个烟草NrHAKl和NtHAKI的相似性仅为48％和49％，所以NsHAKII是一个新的烟草KUP／HAK／KT基因。WolfPSORT预测显示NsHAKll主要定位于细胞质膜中。亚细胞定位试验中NsHAKll与GFP和DsRed2两种报告蛋白融合的定位结果均表明NsHAKll定位于细胞质膜中，与预测结果相符。利用PLACE网站对Nstt~l（11启动子分析得到，NslfAKll可表达与定位于根、花和胚芽组织中，受到低温、高温、干旱和激素等因素的影响。实时荧光定量PCR分析结果与预测结果基本一致：NsHAKII在盛花期林烟草各组织�