游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成
摘要
目的解析Actinoplanes sp. SE50/110（简称SE50/110）中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成机制。 方法经过BLASTp分析，推测了AcbA、AcbB和AcbV负责阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成。首先，本研究在SE50/110中分别构建了acbA、acbB和acbV的同框缺失和回补突变株。然后，利用大肠杆菌BL21（DE3）/pGro7分别对AcbA、AcbB和AcbV成功实现了可溶性表达。最后，以D-葡萄糖-1-磷酸为起始底物，通过体外催化反应，研究脱氧氨基糖单元的生物合成过程和相关蛋白的酶学性质。 结果在SE50/110中分别缺失acbA、acbB和acbV基因后，相应突变株均丧失了阿卡波糖的合成能力，将acbA、acbB和acbV基因分别回补后，各菌株又恢复了阿卡波糖的合成能力，证明了它们均为阿卡波糖生物合成的必需基因。在体外酶促反应中，D-葡萄糖-1-磷酸-胸腺嘧啶转移酶AcbA催化D-葡萄糖-1-磷酸和dTTP合成dTDP-D-葡萄糖，对D-葡萄糖-1-磷酸的Km值为（0.185±0.053）mmol/L，Vmax为（2.366±0.217）μmol/（min·mg）；对dTTP的Km值为（4.964±1.089）mmol/L，Vmax为（60.310±5.419）μmol/（min·mg）。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶AcbB催化dTDP-D-葡萄糖转化为dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖，Km值和Vmax分别为（0.353±0.089）mmol/L和（306.401±28.740）μmol/（min·mg）。氨基转移酶AcbV催化dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖生成dTDP-4-氨基-4，6-双脱氧-D-葡萄糖，Km值和Vmax分别为（1.411±0.293）mmol/L和（3.447±0.279）μmol/（min·mg）。 结论本研究阐明了阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成过程，为全面解析阿卡波糖生物合成途径奠定了基础。同时，测定了相关酶的动力学参数，为代谢工程改造SE50/110，提高阿卡波糖产量提供了重要的理论依据。