刚毛柽柳 NAC24 基因的表达及抗逆功能分析
摘要
目的NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一，广泛参与植物的生长发育过程，并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因，研究该基因的耐盐、抗旱功能，以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。 方法在刚毛柽柳NaHCO3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因，将其命名为ThNAC24（GenBank登陆号：KF031949）。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对，与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L-1 NaCl和400 mmol·L-1甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫，在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况，初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能，分别构建植物过表达（pROKⅡ-ThNAC24）及抑制表达（pFGC5941-ThNAC24）载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达（OE）、抑制表达（IE）及对照（Control）刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺（DAB）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色情况，过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，及电解质渗透率、失水率及丙二醛（MDA）含量，鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。 结果ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp，编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高，具有NAC家族的序列特征；系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示：盐胁迫下，ThNAC24基因上调表达，在根组织中胁迫12 h表达量最高，而叶组织中胁迫24 h的表达量最高；干旱胁迫下，ThNAC24基因上调表达，在根组织中胁迫6 h表达量最高，在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H2O2和超氧阴离子含量，增强了POD和SOD酶的活性，从而减少活性氧（ROS）的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累，从而保护细胞膜结构的完整性。 结论刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫，过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性，进而提高ROS清除能力，减少细胞受损或死亡，从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。