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不对称水解(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯新菌种的分离鉴定及酯酶基因的克隆、表达

卢亚南、Lu Yanan、张朝晖、Zhaohui Zhang、张利坤、Likun Zhang、陆跃乐、Yuele Lu

2016Biochemistry, Genetics and Molecular Biology被引 3

摘要

目的 筛选鉴定1株可以选择性水解农药甲霜灵的中间体(R, S)-2, 6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯(MAP)的菌株，并克隆、表达该菌株中的酯酶基因。 方法 以MAP为唯一碳源，对活性污泥样品中的微生物进行富集培养，采用罗丹明B平板显色法进行初筛，通过摇瓶复筛得到了1株对MAP具有最高对映体选择性和水解活力的新菌株，根据其形态、生理生化特征及16S rRNA序列分析，确立该菌株的系统发育学地位。构建该菌株的基因文库，筛选获得含目的基因的克隆子，通过序列分析和引物扩增得到酯酶基因，将基因与表达载体pET28a (+)连接后，转化大肠杆菌BL21Gold (DE3) plysS，构建重组菌。 结果 该菌属于革兰氏阴性菌，结合16S rRNA基因、形态特征和生理生化实验结果，鉴定该菌为反硝化无色杆菌。通过基因文库法，找到了该菌中的酯酶基因EHest，并成功构建了重组大肠杆菌EHest-pET28a (+)-BL21Gold (DE3) plysS，表达了来自Achromobacter denitrificans 1104且具有不对称水解MAP活性的酯酶EHesterase，大小约27 kDa，表达酶活是原始菌株的27.1倍。用EHesterase催化MAP水解，底物浓度50 g/L，反应1 h，底物转化率为29.5%，产物(酸)的eep为85.1%，对映体选择性为R型。该酶的最适反应pH和温度分别为pH 9.0和50 C。它水解MAP的活性分别是水解橄榄油和乙酸乙酯活性的333倍和667倍。 结论 筛选到1株具有不对称水解MAP能力的新菌株Achromobacter denitrificans 1104。

引用本文（GB/T 7714）

DOI：https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20150545