‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析
摘要
【目的】从地方矮化品种‘南通小方柿’（Diospyros kaki Linn. cv. Nantongxiaofangshi）中分离赤霉素合成关键酶基因 GA2ox，并进行亚细胞定位及表达分析，为进一步探索其矮生性状形成机理及选育新型矮生品种奠定基础。【方法】以‘南通小方柿’幼嫩叶片为材料，通过改良的 CTAB 法提取总 RNA，利用简并引物克隆GA2ox 家族中2个基因的片段，采用3′和5′RACE 方法得到基因的全长 cDNA 序列，分别命名为 DkGA2ox1和 DkGA2ox2。通过生物信息学方法分析结构特征，利用 GFP 进行亚细胞定位，实时荧光定量 RT-PCR 技术研究其在发芽期、展叶期、枯顶期、开花期、生理落果期、果实着色期、果实成熟期中的表达特性。【结果】生物信息学分析 DkGA2ox1和 DkGA2ox2全长 cDNA 序列分别为1318 bp 和1267 bp，分别含有198 bp 和61 bp 的5′非翻译区及97 bp 和172 bp 的3′非翻译区。编码332个和334个氨基酸，与毛白杨（JX102472.1）、夹竹桃（AY594292.1）、烟草（AB125232.1）、矮牵牛（GU059939.1）、苹果（FJ571521.1）、梨（JF441168.1）、葡萄（JQ608472.1）的相似度达73%—77%。含有保守20G-Fe（Ⅱ）-Oxy 蛋白结构域，高度保守的2-酮戊二酸结合位点（DkGA2ox1：Arg-272、Ser-274；DkGA2ox2：Arg-271、Ser-273）和 Fe2＋结合位点（DkGA2ox1：His-205、Asp-207、His-262；DkGA2ox2：His-204、Asp-206、His-261），有赤霉素2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点。DkGA2ox1和 DkGA2ox2编码蛋白分子量分别为36596.1 Da 和37544.2 Da，均为稳定蛋白，无信号肽，无跨膜结构域，无明显疏水区，属于 C19-GAoxs。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后，洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示，DkGA2ox1编码蛋白定位于细胞核和细胞质中。DkGA2ox1和 DkGA2ox2在开花期表达最丰富，并在7个典型物候期中均高于乔化品种‘大方柿’。【结论】南通小方柿中赤霉素2-氧�