pIRES—p16ink4a—hRb1载体的构建及其对骨肉瘤细胞周期的调控
摘要
目的 应用内部核糖体插入位点（IRES）序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a—hRb1并鉴定，观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控。方法 利用基因工程技术，将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中，质粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定；脂质体转染至p161nk4a表达缺失、hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63，G418筛选获得抗性克隆，通过RT-PCR和Western blot法分析外源基因表达；流式细胞术分析细胞周期特异性和细胞凋亡率，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出pIRES-p16ink4a—hRb1载体，外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比较，双基因导人组细胞生长抑制率显著上升，细胞周期显著阻滞在G1期，且细胞凋亡率极显著升高。结论 pIRES-p16ink4a—hRb1双顺反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功，为进一步研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础。
引用本文（GB/T 7714）
廖翔, 杨述华, 邵增务, 等. pIRES—p16ink4a—hRb1载体的构建及其对骨肉瘤细胞周期的调控[J]. 华中科技大学学报：医学版, 2006.
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