RSV编码的4种蛋白在“AcMNPV-sf9昆虫细胞”体系中的重组表达
摘要
应用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV）转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X（pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP）.序列测定表明,目的基因准确地插入到表达载体中.重组质粒pFastBacHTb-X通过转化包含有穿梭载体的大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH10Bac,得到重组穿梭质粒rb-X（rb-NS2、rb-NS3、rb-CP和rb-SP）.rb-X侵染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）离体细胞（sf9）24-72 h后,在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到细胞增大、培养液和细胞内出现颗粒状物质、部分细胞破裂甚至裂解等一系列与正常sf9细胞形态有明显区别的现象.rb-X侵染细胞72h后,从细胞提取蛋白,电泳分析得到4个条带,大小分别为28.2、29.2、40.2和25.2 ku,与预测的4种融合蛋白大小一致.Western blotting分析分别得到4条单一条带,证明了RSV NS2、NS3、CP和SP基因在＂AcMNPV-sf9昆虫细胞＂真核表达体系中成功表达.