携带低氧诱导因子1α~（mu）和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体构建及其在HEK293A细胞中的表达
摘要
背景：低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成,为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证,促进骨愈合,但其真核表达载体的构建及表达却少见报道。目的：实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu（hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α）目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白（human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP）的双基因真核表达载体,并将其转染HEK293A细胞,观测其在细胞中的表达。方法：利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子,之后在基因序列前后添加新的酶切位点NotⅠ和PvuⅠ,酶切、测序检测突变情况,将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。经测序鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况。结果与结论：经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸,终止密码子成功去除。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞。
引用本文（GB/T 7714）
张正, 李谌, 胡亮, 等. 携带低氧诱导因子1α~（mu）和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体构建及其在HEK293A细胞中的表达[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2010.
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